Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Удаляют жидкость из ячеек планшета, покрытого эритроцитами, и трижды промывают каждую ячейку 250-300 мкл СТБ.
Щелочной авидин-стрептавидиновый реагент, связанный с фосфатазой, разбавляют СТБ, содержащим 10 г/л бычьего альбумина R и добавляют в количестве по 50 мкл в каждую из ячеек. Инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре.
Удаляют жидкость из ячеек планшета, покрытого эритроцитами, и трижды промывают каждую ячейку 250-300 мкл СТБ.
В каждую из ячеек добавляют по 100 мкл раствора субстрата и инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 10 минут. Для остановки реакции в каждую из ячеек добавляют по 50 мкл 3 М раствора натрия гидроксида.
Измеряют значения оптической плотности при длине волны 405 нм и вычитают значение, полученное для отрицательного контроля. Значения оптической плотности в области линейности кривой титрования используют для оценки активности испытуемого препарата с использованием обычных статистических методов (5.3).
МЕТОД С
Активность человеческого анти^-иммуноглобулина определяют методом поточной цитометрии в формате титрационного микропланшета. Метод основан на специфическом связывании между анти^-иммуноглобулином и В-положительными эритроцитами. Активность испытуемого препарата сравнивают с препаратом сравнения, калиброванным в Международных Единицах.
За Международную Единицу принимают активность установленного количества Международного Стандартного Образца. Эквивалентность Международного Стандартного Образца в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.
Стандартный образец человеческого анти^-иммуноглобулина BRP калиброван в Международных Единицах в сравнении с Международным Стандартом и предназначен для использования в количественных определениях человеческого анти-й-иммуноглобулина.
МАТЕРИАЛЫ
Реагенты, для которых нет особых указаний, должны быть аналитической степени чистоты.
СФБ. 8,0 г натрия хлорида R, 0,76 г безводного натрия гидрофосфата R, 0,2 г калия хлорида R, 0,2 г калия дигидрофосфата R и 0,2 г натрия азида R растворяют в воде R и разбавляют до 1000 мл тем же растворителем.
Раствор СФБ-БСА. СФБ, содержащий 10,0 г/л бычьего альбумина R.
Эритроциты. Используют й-положительные эритроциты, полученные из группы доноров с группой 0 R1R1 не более, чем за две недели до определения. При необходимости хранят с соответствующим стабилизатором при 40С. Клетки промывают не менее двух раз раствором СФБ-БСА и готовят суспензию, содержащую 1х104, но не более 5х104 клеток в микролитре с использованием раствора СФБ-БСА.
Используют й-отрицательные эритроциты, полученные из группы доноров с группой 0 rr и подготовленные аналогичным образом.
Вторичные антитела. Используют подходящий фрагмент анти-^-антитела, связанный с флуоресцентным красителем, обладающий специфичностью в отношении человеческого IgG или его частей. Хранят и используют в соответствии с инструкциями изготовителя.
Титрационные микропланшеты. Используют плоскодонные планшеты без поверхностной обработки для иммуноферментного анализа.
МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Испытуемые растворы. В случае лиофильно высушенных препаратов их восстанавливают в соответствии с указаниями на этикетке. Готовят не менее чем в трех независимых повторностях не менее трех серийных полутора- или двукратных разведений, начиная с концентрации в диапазоне 1,2-0,15 МЕ/мл с использованием раствора СФБ-БСА. При необходимости, исходное разведение корректируют с целью получения откликов, попадающих в область линейности графика зависимости отклика от дозы.
Растворы сравнения. Восстанавливают препарат сравнения в соответствии с указаниями на этикетке. Готовят не менее чем в трех независимых повторностях не менее трех серийных полутора- или двукратных разведений, начиная с концентрации в диапазоне 1,2-0,15 МЕ/мл с использованием раствора СФБ-БСА. При необходимости, исходное разведение корректируют с целью получения откликов, попадающих в область линейности графика зависимости отклика от дозы.
В каждую ячейку титрационного микропланшета распределяют по 50 мкл й-положительных эритроцитов. К содержимому ячеек каждого ряда добавляют по 50 мкл каждого из разведений испытуемого раствора или раствора сравнения. Используют 50 мкл раствора СФБ-БСА в качестве отрицательного контроля. По 50 мкл й-отрицательных эритроцитов распределяют в четыре ячейки того же микропланшета и добавляют по 50 мкл наименьшего разведения испытуемого препарата. Для отслеживания ложных реакций распределяют по 50 мкл й-положительных эритроцитов в четыре ячейки того же микропланшета и добавляют
по 50 мкл раствора СФБ-БСА. Запечатывают пластиковой пленкой и инкубируют при 370С в течение 40 минут.
Планшеты центрифугируют при 50 g в течение 3 минут, отбрасывают супернатант и промывают ячейки 200-250 мкл раствора СФБ-БСА. Повторяют промывку еще не менее одного раза.
Планшеты центрифугируют при 50 g в течение 3 минут, отбрасывают супернатант и добавляют по 50 мкл вторичного антитела, разбавленного раствором СФБ-БСА до подходящей концентрации белка. Запечатывают пластиковой пленкой и инкубируют при комнатной температуре в защищенном от света месте в течение 20 минут.
